摘要：宫颈癌在现代女性所患恶性肿瘤中位居第二，如果宫颈癌能及早发现，它属于极易治愈的癌症之一。宫颈癌筛查目前被认为是控制宫颈癌发病的最有效手段，可以降低宫颈癌的发病率和死亡率。目前的宫颈癌筛查是采用薄层液基制片技术联合巴氏染色，受多因素影响，这种方法有一定的局限性。酸性磷酸酶检测是一种新近应用于子宫颈异常细胞筛查的化学染色及细胞学检测方法，其检测原理是宫颈异常细胞中酸性磷酸酶活力升高，利用化学染色方法在有酸性磷酸酶活性的细胞内形成红色沉淀。本文分析了酸性磷酸酶染色阳性细胞的特征以及与TCT-巴氏染色样本进行对比观察，提出酸性磷酸酶染色的细胞学诊断标准及报告方式。
关键词：酸性磷酸酶染色；阳性；鉴别诊断
宫颈癌在现代女性所患恶性肿瘤中位居第二，仅次于乳腺癌。据WHO统计，全球每年约有270 000位女性死于宫颈癌，其中85%发生在中低收入国家。全球每年新增的宫颈癌患者超过50万人，其中约50%在亚洲。如果宫颈癌能及早发现，它属于极易治愈的癌症之一。宫颈细胞从高危型人乳头状瘤病毒（high risk human papilloma virus，HR—HPV）持续感染到发展成为癌细胞，是一个逐渐演变的过程，需要l0年或更长时间，如果发现、治疗及时，患宫颈癌的女性可以完全康复。有资料显示，宫颈癌5年生存率分别为Ⅰa期98%～100%；Ⅰb期85%～90%；Ⅱ期65%；Ⅲ期35%；Ⅳ期15%。因此，疾病的早期发现至关重要。世界卫生组织、发达国家的政府以及越来越多的发展中国家的政府都在极力推进和鼓励21岁～64岁的女性，特别是性行为活跃期的女性，不管年龄大小，每年要进行一次宫颈癌的筛查。目前的宫颈癌筛查是采用薄层液基制片技术联合使用巴氏（Papanicolaou，Pap）染色来观察细胞形态学的改变。这是目前发达国家使用的最有效的、性价比最好的宫颈癌筛查方法。遗憾的是，这项技术有很多局限性，如受多因素（取材方法、涂片制作、染色技巧、阅片水平等）的影响，导致假阴性的出现，假阴性率约5%～10%[1]，甚至更高。且过程复杂，难以迎合进行大规模宫颈癌筛查的要求。
酸性磷酸酶检测是一种新近应用于子宫颈异常细胞筛查的化学染色及细胞学检测方法。普遍认为宫颈癌与高危型HPV持续感染直接相关，HPV可诱导溶酶体的生成和增强溶酶体酶的活性。宫颈异常细胞中溶酶体酶活性升高主要有两方面原因：①在宿主细胞中表达的HPV的E7蛋白能显著诱导依赖溶酶体（lysosome）的自噬（autophagy）系统的水平升高[2-3]；②在宿主细胞中表达的HPV的E6蛋白促进p53降解[2，4-5]，这样还可以解除p53对细胞自噬-溶酶体系统的抑制，从而增强该系统的活性[6-7]。在溶酶体包含的众多水解酶中，酸性磷酸酶是有代表性的一种，它的活力可以利用化学染色方法表征，以萘酚盐作为酸性磷酸酶的底物，利用偶氮化合物与硝酸盐作用形成的重氮盐作为偶联物在有酸性磷酸酶活性的细胞内会形成红色沉淀。由此，酸性磷酸酶可以作为感染了HPV的宫颈细胞的标志物。
近年来，关于利用“酸性磷酸酶在异型细胞中高表达”原理检查宫颈异型细胞的报道逐渐增加。1960～1980年间，仅有的两篇文章报道了宫颈癌细胞内酸性磷酸酶的表达[8-9]，并没有引起足够重视。直到1997年后，酸性磷酸酶才被视作一种潜在的宫颈癌检测生物标志物[10-11]。随后，有一些研究证实了酸性磷酸酶作为标志物用于宫颈异常细胞检测的先进性：采用RT—PCR、Western blot和免疫组化法分别检测正常宫颈、CIN I-III级患者组织中酸性磷酸酶的表达情况，结果证实酸性磷酸酶水平在宫颈癌发生过程中的各级别病变组织中呈明显增高趋势[12]。酸性磷酸酶检测结合巴氏染色可以显著提高样本阳性/异常检出率并且降低假阴性率[13-14]。对TCT结果阳性的病例进行酸性磷酸酶染色复查，结果显示，与巴氏染色相比，酸性磷酸酶染色较易寻找阳性细胞，阅片时间短，检测诊断结果的可重复性高。对不能明确意义的非典型鳞状上皮细胞（ASCUS）诊断率减少，低度鳞状上皮内病变（LSIL）阳性率明显升高，高度鳞状上皮内病变（HSIL）及鳞状细胞癌（SCC）阳性率持平[15]。采用酸性磷酸酶和巴氏染色对妇科门诊患者的宫颈脱落细胞进行染色，敏感性100%，特异性高于93%，酸性磷酸酶筛查宫颈异常细胞的检出率明显高于巴氏染色[16]。因为此种染色法具有种种优势，酸性磷酸酶染色有希望成为下一代细胞学检测所依赖的染色方法。
1 资料与方法
选取2012年1月～2014年3月宫颈细胞TCT检查诊断正常病例20例和有不典型鳞状上皮的病例100例，其中不典型鳞状上皮的病例包括不能明确意义的非典型鳞状上皮细胞（ASCUS）、不排除高度鳞状上皮内病变（ASC-H）、低度鳞状上皮内病变（LSIL）、高度鳞状上皮内病变（HSIL）及鳞状细胞癌（SCC）和腺癌，年龄25～67岁。
样本染色酸性磷酸酶染色应用“宫颈异常细胞快速筛查试剂盒（FSC-811）及保存液”由合肥安旸公司提供。FSC-811保存液保存标本，采用膜式制片（利普制片机，吉林万方医疗）同时制作两张薄片。一张巴氏染色，中性树胶封固；另一张用FSC-811试剂盒进行酸性磷酸酶染色，水性封片剂（合肥安旸）封固。所有样本评估均为满意。
2 结果
2.1镜检 酸性磷酸酶染色阳性细胞的细胞质中出现红色颗粒状沉淀，所有正常鳞状上皮均为染色阴性。酸性磷酸酶染色阳性细胞包含5种：①正常宫颈腺上皮细胞（柱状上皮细胞，图1a，b），细胞质中充满鲜艳的红色颗粒；②吞噬细胞，细胞质中充满鲜艳的红色颗粒（图1 c），以上两种细胞具有很高的自噬-溶酶体活力，所以正常情况下酸性磷酸酶的表达水平非常高，可以作为此种染色的阳性对照细胞；③化生细胞，从柱状上皮过渡到鳞状上皮的过程中，酸性磷酸酶表达水平逐渐降低，红色颗粒逐渐减少直至消失（图1 d）；④基底层细胞，正常的宫颈上皮细胞中酸性磷酸酶表达随基底层-中层-表层的成熟过程而逐渐降低[13]，宫颈萎缩样本中存在的基底层细胞会出现红色颗粒（图1e）；⑤不典型鳞状上皮，各级别的异型细胞均表达酸性磷酸酶，FSC-811染色均为阳性，但单个细胞中的红色颗粒数量不随级别的升高而增加，这可能与保存条件和染色操作有关。
因为宫颈腺上皮细胞和吞噬细胞较易辨识，阅片时只需要区分化生细胞、基底层细胞和异常的上皮细胞即可。镜下仅需要观察细胞质染红的细胞，如果不属于前四种酸性磷酸酶染色阳性细胞，即为异常细胞。
酸性磷酸酶染色与巴氏染色异型细胞鉴别镜下逐个寻找细胞质出现红色颗粒状染色的细胞或细胞团。异常的上皮细胞经过FSC-811染色胞质中出现红色颗粒，核质比增大，核膜增厚清晰，核异型，深染，核质堆积，多核，部分见核仁，核分裂，胞体增大，细胞离散或细胞堆积，堆积时形成的多核，其边界呈明显立体结构的不规则、奇异突起。对胞质红染而细胞无异型的非阳性对照细胞作出阴性诊断。
2.2酸性磷酸酶诊断标准
2.2.1⑴未见上皮内病变、恶性细胞 ①柱状和化生细胞红染，未见上皮内病变、恶性细胞；②鳞状上皮细胞，未见上皮内病变、恶性细胞。⑵病原微生物。⑶其他非肿瘤所见。⑷子宫内膜细胞≥40岁。
2.2.2上皮细胞异常
2.2.2.1鳞状上皮细胞异常 ⑴ASC-US：①鳞状分化，核浆比增高，核大于正常细胞核的2.5倍轻度核深染染色质成块不规则，模糊不清；②如见到与HPV感染有关的胞浆改变核周空晕；③强嗜橘黄细胞角化不全。⑵ASC-H：①核浆比高的小细胞非典型不成熟化生；②密集成片型浓稠胞浆，其核较正常细胞核大1.5～2.5倍。⑶LSIL：①表层型胞浆的细胞核面积大于中层细胞核的3倍，核深染，染色质均匀分布但常呈出颗粒状，核膜轻度不规则，但可见光滑；②挖空细胞；③核周胞浆空腔化的细胞，必须同时具有核的异型性。⑷HSIL：病变细胞小而较不成熟细胞大小不一、核深染、核浆比明显增高核膜很不规则有明显的内凹或核沟。⑸SCC：①角化型鳞状细胞癌，细胞大小形状差异大，核膜不规则，染色质呈出颗粒状，可见肿瘤素质；②非角化型鳞状细胞癌，细胞一般比许多高级别病变的细胞小，但具有高级别病变的的大多数特点，染色质粗，块状、肿瘤素质常见，核仁大而显著；③腺上皮细胞异常：非典型腺细胞成片，排列拥挤核，核增大正常核的3～5倍，核大小形状轻度不一，核轻度深染，胞浆丰富但核浆比增高。
非典型腺-倾向瘤变细胞呈片状核拥挤重叠，核增大染色质稍增多，核浆比升高，细胞界限不清。
原位腺癌细胞呈片状，簇状，核菊蕊团形式，核拥挤重叠，细胞团有呈现栅栏状排列的细胞核，核及带状胞浆从细胞团周边伸出羽毛状结构特点。明显的柱状形态出现核增大大小不一，核染色过深有均匀分布的粗颗粒状染色质核浆比增高，背景干净，核仁明显。
腺癌与原位腺癌相同，但有侵袭特点，可见巨大核仁，胞浆通常有空泡，可见肿瘤素质。
3 讨论
子宫颈脱落细胞酸性磷酸酶检测作为一种新的检测方法越来越受到研究人员及病理医生的关注，此方法在形态学观察的基础上加入了生物标志物，提高了细胞学检测的敏感性和准确性，酸性磷酸酶作用底物产生的红色物质位于胞浆，结合常规核染色，不仅增加了观察的可视性，同时使细胞信息最大化，大大缩短检测时间和减少阅片工作量。
鉴于这种新方法目前没有国际通用的诊治方案，我们提出：子宫颈脱落细胞酸性磷酸酶检查结果如为低度鳞状上皮内病变（L-SIL）、高度鳞状上皮内病变（H-SIL）或倾向于高度病变的不典型鳞状上皮细胞（ASC-H）时，均应进行阴道镜下活检，确定诊断以后再予以相应处理；若细胞学检查结果为未明确意义的不典型鳞状上皮细胞（ASC-US）时，不一定要立刻进行阴道镜检查，可以3～6个月后重复酸性磷酸酶检测，若仍为ASC-US，作阴道镜下活检。
与巴氏染色相比，酸性磷酸酶染色用于筛查在诊断的时间控制上有一定的优势，镜下观察易识别，色泽与背景具有对比性，反差明显，易于寻找，层次感强、炎性细胞等因素影响减少，使得诊断更加快捷，这更有利于年青医师的阅片，也便于应对大批量的筛查工作。酸性磷酸酶检测的最大优点之一是敏感性高，对于染色阳性的细胞再进一步观察形态学特征，而不用考虑酸性磷酸酶染色阴性的细胞。在条件较差的基层单位或社区医院缺乏有经验细胞学专家的情况下更容易开展筛查工作。
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编辑/王敏