[摘要] 目的 探讨竹荪水提物对肺癌细胞的抑制效应。 方法 选取路易斯肺癌细胞（LLC）为靶细胞，接种于48孔或96孔板，接种密度分别为2×104/孔和1×104/孔，加入不同浓度的竹荪水提物：0、1、2 mg/mL，培养1～3 d，分别采用镜下观察、细胞计数试剂盒（CCK-8）、流式细胞学和细胞实时分析系统（RTCA）检测细胞生长状态。 结果 镜下直接观察，与对照组比较，竹荪水提物处理组LLC细胞数量明显较少，高浓度组细胞生长状态不佳；CCK-8检测结果显示，高浓度组OD450为0.24，仅为对照组的一半（0.59），细胞增殖受到明显抑制，抑制率为59%（P < 0.05）；流式细胞学检测显示，经竹荪水提物处理后，LLC早期凋亡比例由6%上升到48%，凋亡及死亡细胞比例由41%上升到68%；RTCA实时监测数据显示，竹荪水提物高浓度处理组LLC生长的电阻值为0，低浓度组为0.4，对照组为3.7，细胞贴壁生长状态呈剂量-效应关系。 结论 竹荪水提物可以抑制LLC生长。
[关键词] 竹荪；水提物；LLC；增殖；抑制
[中图分类号] R734.2[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）06（a）-0009-04
Inhibition effect study of aqueous extract from dictyophora indusiata on lewis lung cancer cell
WANG Xiaohong1 JIANG Hong2 YU Xinmin1
1.Department of Chemotherapy, Zhejiang Provincial Cancer Hospital, Zhejiang Province, Hangzhou 310022, China; 2.Department of Thoracic Surgery, the First People"s Hospital of Hangzhou City, Zhejiang Province, Hangzhou 310006, China
[Abstract] Objective To study the inhibition effect of aqueous extract from Dictyophora indusiata on Lewis lung cancer cell. Methods LLCs were seeded in 48-well or 96-well plate, with each well containing 2×104/well and 1×104/well, respectively. Different concentration aqueous extract from Dictyophora indusiata (DI) (0, 1, 2 mg/mL) were added into culture system, after 1-3 days, the cell status, proliferation and apoptosis were detected by microscopy, CCK-8 kit, flow cytometry and real time cell analysis system. Results Comparison to control group, the cell number of DI treated group obviously decreased. Furthermore, the cell status was weak in high dose group. The OD450 value of high dose group (0.24) was only half of the control group (0.59) in the CCK-8 experiment, and it indicated that the cell proliferation was inhibited with the inhibited rate of 59% (P < 0.05). In flow cytometry analysis, the apoptosis in early stage of control group was 6%, while it increased to 48% in DI treated group. The total death cell from 41% increased to 68% after DI treated. The results of RTCA showed that the proliferation of LLC obviously inhibited by DI, with the CI was 0 in high dose group and 0.4 in low dose group, and 3.7 in control group, and there was dose-effect relationship. Conclusion DI aqueous extract has the inhibition effect on LLC.
[Key words] Dictyophora indusiata; Aqueous extract; Lewis lung cancer; Proliferation; Inhibition
竹荪（Dictyophora indusiata）是一种担子菌，隶属真菌门（Eumycota）、担子菌亚门（Basidiomycotina），具有较高的药用价值。竹荪中活性的成分较多，多糖是其中具有较高活性的一种大分子物质，目前研究发现竹荪多糖在抑菌、抗氧化、免疫调节等方面都有一定的效果，尤其引人瞩目的是其抗肿瘤作用。已有研究发现竹荪多糖具有抗S180肿瘤的效应[1]。肺癌居于人类癌症发病谱和死因谱的首位[2]，寻找能抑制肺癌的生物活性分子具有重要的现实意义，竹荪提取物对肺癌的抑制效应尚未见研究。本研究拟通过将不同浓度的竹荪水提物作用于路易斯肺癌细胞（LLC），分别采用镜下观察、细胞计数试剂盒（CCK-8）、流式细胞学和细胞实时分析系统（RTCA）检测细胞生长状态，探讨竹荪提取物对肺癌细胞的抑制效应，为肺癌的治疗提供新的候选药物。
1 材料与方法
1.1 材料
碘化丙啶（PI）和FITC-Annexin V购自美国BD公司，培养基为调整型依格尔培养基（DMEM），内含10%新生小牛血清（Gibco，美国），肿瘤细胞系为LLC（中科院上海细胞库），CCK-8试剂盒购自庄盟（北京）。显微镜为CKX41（奥林巴斯，日本），流式细胞仪为FACSCalibur（BD，美国），实时细胞分析系统为RTCA xCELLigence（艾森，中国）。
1.2 竹荪水提物的制备
以1∶50的料液比向竹荪中加入蒸馏水，70℃，2 h，用纱布过滤，滤液中按1∶2的比例加入乙醇（V∶V），离心10 000 r/min，5 min，取沉淀，烘干得到竹荪水提物。根据提取物浓度，将其分为对照组（0 mg/mL）、低浓度组（1 mg/mL）、高浓度组（2 mg/mL）。
1.3 光镜下直接观察
LLC按1×104接种于96孔板，培养体系为100 μL，培养基为DMEM，培养基含有10%新生小牛血清，青霉素浓度为100 U/mL，链霉素浓度为100 μg/mL。加入不同浓度的竹荪水提物，37℃，5%CO2，培养3 d，光镜下观察细胞生长状态。
1.4 CCK-8检测细胞增殖
LLC按1×104接种于96孔板，加入不同浓度的竹荪水提物，37℃，5%CO2，培养3 d，每孔加入10 μL CCK检测试剂，2 h后酶标仪扫描，扫描波长为450 nm，每个浓度组样本数为3。
1.5 流式细胞学检测细胞凋亡
LLC按2×104接种于48孔板，加入不同浓度的竹荪水提物，37℃，5%CO2，培养3 d，收集细胞，采用PI和Annexin V双染，Annexin V单阳性为早期凋亡细胞，Annexin V和PI双阳性细胞为晚期凋亡细胞和死亡细胞。
1.6 RTCA检测
RTCA检测系统中，细胞贴壁生长，培养板下方的微电极会将细胞生长状态转换为电阻信号，细胞越多，电阻越大，如果细胞死亡，那么检测电信号就会降低至零，这些变化可以通过该分析系统用细胞电阻值的形式实时反映出来[3]。LLC按1×104接种于96孔检测板，加入不同浓度的竹荪水提物，37℃，5%CO2，每个浓度组样本数为3。
1.7 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料组间均数比较采用方差分析，采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 镜下直接观察
对照组细胞生长良好，排列紧密，形态成梭形，胞质透亮饱满，细胞之间形成连接；竹荪提取物低浓度组细胞生长稀疏，细胞间连接大量减少，高浓度组中细胞成皱缩状态，数量更少，鲜见细胞连接（图1）。
2.2 细胞增殖实验
随着竹荪提取物浓度的增加，LLC细胞增殖逐渐下降（F = 97.60，P < 0.05），呈现明显的生长抑制效应，OD值高浓度组（0.24）仅为对照组（0.59）的一半，差异有统计学意义（P < 0.05）（图2）。
2.3 流式细胞学检测
为研究竹荪提取物是否诱导LLC凋亡，对竹荪处理后的LLC进行了PI和Annexin V双染，右下下限[Annexin V（+）]为早期凋亡细胞，右上上限[Annexin V（+）PI（+）]为晚期凋亡及坏死细胞，结果显示竹荪处理组，早期凋亡细胞由6%上升到48%，凋亡及死亡细胞由41%上升到68%（图3）。
图3 竹荪水提物促进路易斯肺癌细胞凋亡的流式分析结果
2.4 细胞电阻值实时监测
在RTCA检测系统中，对照组LLC细胞生长良好，培养板底面的电阻值不断上升，培养32 h后，细胞电阻值达到3.7，而竹荪水提物低浓度组电阻值为0.4，说明贴壁生长的LLC数量很少，竹荪水提物高浓度组电阻值为0，显示LLC细胞生长受到明显抑制，呈现剂量-效应关系（图4，见封三）。
3 讨论
真菌提取物具有抗肿瘤效应已引起人们广泛关注[4-5]，其中香菇多糖已经开发出了相应的口服药及注射针剂[6]。人们已发现竹荪多糖具有体内外抗氧化[7-8]及抗肿瘤的效应。Ukai等[9]通过体内实验发现竹荪多糖T-4-N[分子量（Mw）：5.5×106 Da]、T-5-N（Mw：5.5×106 Da）可以在相对较低剂量下抑制S180皮下移植瘤的生长。Deng等[10]发现竹荪多糖PD3（Mw：5×105 Da）在体外不能抑制S180，在体内可以抑制，该研究推测PD3不是依靠细胞毒性杀伤肿瘤细胞，而是激活了机体免疫细胞，从而发挥间接杀伤肿瘤的作用，研究RPD3抑制S180的活性，结果发现RPD3抑瘤效应更强，RPD3是PD3经NaOH处理后变性再透析脱碱复性的产物，结构分析显示RPD3的糖链结构更松散，研究者推测这种结构变化有利于暴露出更多的侧链结构，从而更多的结合免疫细胞表面的相应受体，刺激细胞增殖。Zhong等[1]发现竹荪多糖PDI（Mw：6.5×104 Da）在体外可以直接抑制S180细胞，并诱导其凋亡增加及阻滞细胞周期有关，该效应与凋亡相关基因Bcl-2、Bax、P53及细胞周期蛋白Cyclin D、CDK4相关。Li等[11]发现竹荪粗多糖可以在体外抑制Hela和HepG2的生长，且对前者的抑制效应强于后者，而对人正常血管内皮细胞抑制效应很弱，显示了良好的应用前景。Hua等[12]发现竹荪水提多糖可以增加胸腺重量，提高单核细胞吞噬能力。从以上研究中可见，不同竹荪组分对肿瘤细胞效应不同，有的具有直接抑制效应，有的是间接抑制效应，在结构研究方面，研究认为β-1→3D葡聚糖是抑瘤的基本结构[13]。但是竹荪对于肺癌细胞有无抑制效应尚不明确。
本研究结果发现，竹荪水提物具有直接抑制肺癌细胞生长的效应，能引起肺癌细胞凋亡。本研究中水提物的方法为水煮醇沉，是竹荪粗多糖的常规提取工艺，只是没有去蛋白的环节，但是可以推测本研究中的竹荪水提物成分还是以粗多糖为主，含有少量的糖蛋白及蛋白成分。对比文献[8]中竹荪多糖PD3（Mw：5×105 Da）在体外不能抑制S180，而文献[1]中竹荪多糖PDI（Mw：6.5×104 Da）在体外可以直接抑制S180细胞，文献[9]中竹荪粗多糖具有体外抑制Hela和HepG2的生长，再结合本研究中竹荪水提物可以体外抑制LLC的效应，本研究推测竹荪粗多糖中含有两大类抗肿瘤成分，一类是直接抑制肿瘤成分，另一类是间接抑制肿瘤成分，竹荪粗多糖的提纯过程中，例如分离到PD3，该直接效应消失，即直接抑制肿瘤的成分被去掉，此时发挥效应的就是间接抗肿瘤的部分，即发挥体内抗肿瘤作用。
本研究的细胞凋亡检测中，低浓度竹荪水提物即可大幅提高LLC细胞早期凋亡的比例，说明竹荪作为一种菇类食物，其水提物性质较为温和，作用于肿瘤细胞时，不是引起激烈的坏死效应，而是较为温和的细胞凋亡方式，一般不会引起坏死因子释放，副作用较小，为肺癌患者的食疗提供了候选食材，本研究的发现还为新型抗肺癌药物研发提供了参考，从竹荪多糖中进一步分离、筛选抗肺癌的组分提供了依据。
[参考文献]
[1]Zhong B，Ma Y，Fu D，et al. Induction of apoptosis in osteosarcoma s180 cells by polysaccharide from Dictyophora indusiata [J]. Cell Biochem Funct，2013，31（8）：719-723.
[2]段纪俊，陈万青，张思维.中国恶性肿瘤死亡率的国际比较[J].中国社会医学杂志，2009，26（6）：377-378.
[3]Solly K，Wang X，Xu X，et al. Application of real-time cell electronic sensing （RT-CES） technology to cell-based assays [J]. Assay Drug Dev Technol，2004，2（4）：363-372.
[4]Jiao C，Xie Y，Yang X，et al. Anticancer Activity of Amauroderma rude [J]. PLOS One，2013，8（6）：e66504.
[5]Qi C，Cai Y，Gunn L，et al. Differential pathways regulating innate and adaptive antitumor immune responses by particulate and soluble yeast-derived β-glucans[J]. Blood，2012，117（25）：6825-6836.
[6]Ina K，Kataoka T，Ando T. The use of lentinan for treating gastric cancer[J]. Anticancer agents Med Chem，2013，13（5）：681-688.
[7]Deng C，Hu Z，Fu H，et al. Chemical analysis and antioxidant activity in vitro of a β-D-glucan isolated from Dictyophora indusiata [J]. Int J Biol Macromol，2012，51（1-2）：70-75.
[8]Hua Y，Yang B，Tang J，et al. Structural analysis of water-soluble polysaccharides in the fruiting body of Dictyophora indusiata and their in vivo antioxidant activities [J]. Carbohyd Polym，2012，87（1）：343-347.
[9]Ukai S，Kiho T，Hara C，et al. Polysaccharides in Fungi XⅢ.Antitumor activity of various polysaccharides isolated from Dictyophora indusiata，Ganoderma japonicum，Cordyceps cicadae，Auricularia auricular-judae，and Auricularia species [J]. Chem Pharm Bull，1983，31（2）：741-744.
[10]Deng C， Fu H， Teng L， et al. Anti-tumor activity of the regenerated triple-helical polysaccharide from Dictyophora indusiata [J]. Int J Biol Macromol，2013，61：453-458.
[11]Li X，Wang Z，Wang L，et al. In Vitro Antioxidant and Anti-Proliferation Activities of Polysaccharides from Various Extracts of Different Mushrooms[J]. Int J Mol Sci，2012，13（5）：5801-5817.
[12]Hua Y，Gao Q，Wen L，et al. Structural characterisation of acid-and alkali-soluble polysaccharides in the fruiting body of Dictyophora indusiata and their immunomodulatory activities [J]. Food Chem，2012，132（2）：739-743.
[13]张忠，程富胜，贾宁，等.小鼠溃疡性结肠炎模型的建立及病理组织学比较[J].中国实验动物学报，2012，20（6）：69-72，后插4.
（收稿日期：2014-03-05本文编辑：卫轲）