摘要：介绍了一种运用激光扫描共聚焦显微术显示土壤原生动物细胞结构的方法，试验结果较清晰地显示出该纤毛虫细胞表面纤毛器及纤毛器基部附属微管结构，并总结了试验操作过程中的注意点。
关键词：激光扫描共聚焦显微术；土壤原生动物；细胞结构
中图分类号：Ｑ－３３６ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）09－1888-02
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｏ Ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ
Ｓｏｉｌ Pｒｏｔｏｚｏａ
ＹＵＮ Ｍｉ－ｘｉａ，ＧＵＯ Ｊｉａｎ，ＮＩ Ｂｉｎｇ，ＳＨＥＮＧ Ｘｉｎ，ＣＨＥＮ Ｊｉ－ｗｕ，ＧＵ Ｆｕ－ｋａｎｇ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｅａｓｔ Ｃｈｉｎａ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００６２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ cell ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ． Ａｎｄ ａｌｓｏ， ｔｈｅ ｋｅｙｓ ｉｎ ａｃｔｕａｌ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｓｕｍｍａｒｉｅｄ． Ｔｈｅ ｃｉｌｉａｔｕｒｅ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌａｒ ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｂａｓｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ｉｎ ｔｈｅ cell surface ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｒｏｔｏｚｏａ ｗｅｒｅ ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ ｓｈａｒｐｌｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ； ｓｏｉｌ ｐｒｏｔｏｚｏａ； cell ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
在农林土壤生态系统中，土壤原生动物是土壤动物区系不同水平生物之间形成食物链结构的一个环节，其不仅加强了土壤营养物质再循环的效应，而且还在促进植物根系对营养物质的吸收和加强植物生长方面起着重要的作用［１］。目前对土壤原生动物的研究在宏观生态学方面取得了较多的成果，但对土壤原生动物形态的观察则仍主要应用光学显微镜，尚未深入到其胞器结构水平。
激光扫描共聚焦显微镜在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，用紫外或可见光激发荧光探针，从而显示细胞或组织内部微细结构的荧光图像［２］。利用它对样品的连续断层扫描和三维重建图像技术，将获得的一系列连续扫描图像进行合成，不但可以获得清晰的细胞结构和细胞的长、宽、厚、断层面积、细胞体积等参数，并且能随意观察细胞各个侧面的三维立体结构［２］。目前激光扫描共聚焦显微镜三维重建组织细胞结构的方法已普遍运用到细胞结构的研究中［３，４］，但运用该技术来显示土壤原生动物胞器结构的研究鲜见报道。近年来作者所在实验室摸索出一种运用激光扫描共聚焦显微镜三维图像重建技术与荧光紫杉醇（ＦＬＵＴＡＸ）直接荧光技术相结合，显示出土壤纤毛虫胞器的三维立体结构的方法，取得了较理想的效果，现将此方法介绍如下。
１材料与方法
１．１试验材料
细胞材料：取采自浙江温州青龙湖地区的一种土壤纤毛虫，用麦粒发酵液获得的细菌作为饵料，建立纯系培养。待纤毛虫培养至较高密度后，取生长状态良好的细胞作为试验材料。
试剂制备：①ＰＨＥＭ缓冲液（６０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＰＩＰＥＳ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ，１０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＧＴＡ，６ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣＩ２·６Ｈ２Ｏ，ｐＨ值６．９）；②０．５％皂苷溶液（０．５ ｇ皂苷，ＰＨＥＭ缓冲液定容至１００ ｍＬ）；③４％多聚甲醛固定液（４ ｇ多聚甲醛，ＰＨＥＭ缓冲液定容至１００ ｍＬ）；④０．５％的Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ １００渗透液（０．０５ ｍＬ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００，ＰＨＥＭ缓冲液定容至1０ ｍＬ）；⑤ＰＢＳ磷酸盐缓冲液（１３６．８ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，２．７ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣＩ，１０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４，１．８ ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ值７．４）；⑥ＦＬＵＴＡＸ－２：７－Ｏ［Ｎ－（４’－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎｃａｒｂｏｎｙｌ）－Ｌ－ａｌａｎｙｌ］Ｔａｘｏｌ（购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司），规格为５０ ｍｇ，先用二甲亚砜（ＤＭＳＯ）配制成１ ｍｍｏｌ／Ｌ的母液，分装后置于－２０℃保存，使用时用ＰＢＳ将其稀释至１ μｍｏｌ／Ｌ。
１．２试验方法
荧光紫杉醇直接荧光标记制备激光扫描共聚焦标本采用ＦＬＵＴＡＸ法［５－７］，其主要步骤为：①在载玻片上滴１００ μＬ浓度为０．５％的皂苷，将高浓度的细胞滴入皂苷中渗透１０ ｓ，用ＰＨＥＭ清洗１次；②４％多聚甲醛中固定５ ｍｉｎ，ＰＨＥＭ清洗１次；③０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００处理１０ ｓ，ＰＨＥＭ清洗１次；④１ μｍｏｌ／Ｌ ＦＬＵＴＡＸ－２染色５ ｍｉｎ，０．０１ ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ漂洗６次。
激光扫描共聚焦显微镜（ＬＥＩＣＡ ＴＣＳ ＳＰ５）操作：①打开计算机、显微镜及荧光电源；②选用染料ＦＩＴＣ的波长及激光管，观察标本，找到观察对象；③光路转换至扫描观察模式，设置扫描分辨率、目镜倍数和扫描放大倍数等，快速预览，调整激光管电压、光电倍增功率等至最佳状态；④拍照采集共聚焦图像，进行三维重建，获取图像并保存。
２结果与分析
激光扫描共聚焦显微镜术显示，这种土壤纤毛虫细胞表面纤毛器由口围带、波动膜、额腹横棘毛、左右缘棘毛等纤毛器微管组成，其细胞表膜下含口围带基部小膜托架及与托架相联系的微管，额腹横棘毛基部前纵微管束、后纵微管束、横微管束等纤毛器基部附属微管（图１）。分析其细胞的运动胞器及其细胞骨架，可揭示该纤毛虫在土壤结构中的运动、取食及与土壤环境的作用关系。
３小结与讨论
激光扫描共聚焦显微镜所显示的细胞结构三维图像分辨率高，背景干扰少，图像清晰度高而且还可以使细胞旋转，随意观察各个侧面的结构。一张理想的激光扫描共聚焦照片，需要做到其所显示的图像反差适中、细胞饱满而不变形、细胞结构清晰。根据作者的实践，成功的关键主要涉及原生动物细胞的状态、选择合适的载玻片、防止样品干燥和对样品的冲洗及标本的照相等方面，例如，应该选择生长状态良好的原生动物作为材料，这样得到的样品一般是内部结构比较均一且细胞形态比较完整；选择０．１３～０．１７ ｍｍ厚的盖玻片作为制备样品的载玻片，无需使用盖玻片，可以保证在扫描过程中得到整个细胞各个不同面的切片，保持细胞原有的形态；由于不盖片，样品容易干燥，防止样品干燥是很关键的一步，因此载玻片上要留有足量的缓冲液，同时在观察样品的过程中应每隔１０ ｍｉｎ向载玻片上滴加一次缓冲液；另外在染色过程中要避光，ＦＬＵＴＡＸ染色前后用ＰＢＳ清洗多次，以洗去未结合的ＦＬＵＴＡＸ以及染上ＦＬＵＴＡＸ的杂质，提高对比度，减少背景色干扰；最后激光扫描共聚焦显微镜拍照时，快速找到观察对象，光路转换至扫描观察模式，调至最佳状态，对样品进行左右、上下不同层次扫描，拍照采集不同层面的图像，进行三维重建。
该方法也适用于其他土壤微生物标本的制备和观察，对不同水体的微生物细胞结构的研究也具有参考价值。
参考文献：
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［４］ 林钰龙，陈耀文， 刘鸿禧，等．激光扫描共聚焦显微镜对人类染色体三维结构的观察［Ｊ］． 激光生物学报，２００２，１１（１）：３４－３６．
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