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【摘要】目的：采用免疫组织化学法检测HPV L1壳蛋白的表达，并进一步分析研究其与宫颈病变的严重程度的关系。方法：选取我院妇科就诊患者的宫颈脱落细胞标本529例，所有患者进行薄层液基细胞学检查，同时行宫颈活检并采用免疫组织化学法检测HPV L1壳蛋白的表达，并且分析其与不同程度宫颈病变的相关性。结果：在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈鳞癌中，HPV L1壳蛋白的阳性表达率分别为2616%、6076%、3098%、1654%、0%，CINⅠ组与CINⅡ组、CINⅢ组和宫颈鳞癌组的HPV L1壳蛋白阳性表达率之间差异性均具有统计学意义（P均<005）。在NILM、ASCUS、 LSIL、HSIL、SCC中，HPV L1壳蛋白的阳性表达率分别为2015%、3529%、6363%、1839%、0%，HSIL组与 LSIL组的HPV L1壳蛋白的阳性表达率之间的比较，差异有显著统计学意义（P均<005）。结论：HPV L1壳蛋白的表达随宫颈病变程度的加重而降低，表明HPV L1壳蛋白表达的检测对癌前病变的筛查和预防有着重要意义。
【关键词】免疫组织化学法；HPV L1壳蛋白；宫颈病变
Relationship between the expression of HPV L1 protein shell and severity of cervical lesionsYE Qiong1， JIANG Yi1△， WANG Huan1， CHEN Liya1， ZOU Qiongyu1， KE Xiaohui2. 1.Department of Pathology， Wenzhou Central Hospital， Wenzhou 325000， Zhejiang， China； 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Wenzhou Central Hospital， Wenzhou 325000， Zhejiang， China
【Abstract】Objectives： To study the relationship between the expression of HPV L1 protein shell and the severity of cervical lesions using immunohistochemical method. Methods： 529 patients in the gynecologic endocrine clinic of our hospital were chosen. Cervical exfoliated cells specimens and thin layer liquid based cytology examination were performed on all patients. Meanwhile， immunocytochemistry method was used to detect HPV L1 shell protein expression and analyze its correlation with different degrees of cervical lesions. Results： In chronic cervicitis， CINⅠ， CINⅡ， CINⅢ and cervical adenocarcinoma， the positive expression rate of HPV L1 shell protein were 26.16%， 6076%， 3098%， 16.54% and 0% respectively. Difference in HPV L1 protein positive expression rate between CINⅠ group and CINⅡ， CINⅢ and cervical adenocarcinoma was statistically significant （P<005）. In NILM， ASCUS， LSIL， HSIL and SCC， the HPV L1 shell protein positive expression rate were 2015%， 35.29%， 63.63%， 18.39% and 0%， with statistically significant difference between HSIL and LSIL group （P<005）. Conclusions： The expression of HPV L1 protein shell reduces with the increase of cervical lesion degree， suggesting that HPV L1 protein expression detection is of important significance in the screening and prevention of precancerous lesions.
【Key words】Immunocytochemistry method； HPV L1 protein shell； Cervical lesions
【中图分类号】R7373【文献标志码】A
宫颈癌是临床上常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌，我国每年大约近3万人死于宫颈癌＼[1-4＼]。近年来，由于环境恶化及生活、工作压力的增加，宫颈癌发病有年轻化的趋势。由于宫颈癌的形成需要一段较长的、可逆转的癌前病变期，因此，早期发现、早期诊断有助于减少宫颈癌死亡病例＼[5-7＼]。引起宫颈癌的病因主要是感染高危型HPV，HPV L1壳蛋白为HPV病毒的主要壳蛋白，对HPV L1壳蛋白表达的检测可体现病毒的感染状态。本文采用用免疫细胞化学法检测HPV L1壳蛋白的表达，并进一步分析研究其与宫颈病变的严重程度关系，现报道如下。
1材料和方法
11一般资料
选取我院2013年2月至2013年8月检查的529例妇女，均进行宫颈薄层液基细胞学、HR-HPV DNA及组织病理学检查，年龄24～65 岁，平均年龄（346±147）岁，其中宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及浸润性宫颈鳞癌例数分别为237例、83例、71例、133例、5例。排除标准：无子宫颈手术史或子宫切除史，受检时无妊娠。所有患者签署知情同意书，本研究经我院伦理委员会批准后实行。
12方法
121宫颈薄层液基细胞学在阴道扩张器直视下操作，将专用宫颈刷插入宫颈管内，当周边的刷丝触碰到宫颈外口黏膜面时，顺时针或逆时针旋转3～5圈。拿出宫颈刷，卸下刷头将其放入盛有细胞固定液的标本瓶中，盖紧激烈摇匀，贴上标签后备用，经ThinPrep 2000系统程序化处理制成直径为 18mm的薄层细胞片。进行巴氏染色，所有巴氏染色片是由两位细胞病理医师读片。依据TBS（ the Bethesda system） 分级系统分为5 组：（1）良性或者正常（NILM）；（2）未明确意义的不典型鳞状上皮细胞（ASCUS）；（3）低度鳞状上皮内病变（ LSIL） ；（4）高度鳞状上皮内病变（ HSIL） 及原位癌；（5）鳞状上皮浸润癌（SCC）＼[8＼]。
122HPV-DNA检测用杂交捕获二代系统检测高危型 HPV 病毒： 通过杂交捕获二代检测系统对所取标本行HPV16、18、31、33、35、39、45等13种常见的HPV高危型检测。HR-HPV DNA>10 pg/mL为阳性。
123组织病理检测所有患者均行阴道镜检查，对宫颈异常部位进行活检，必要时行宫颈管搔刮。所有标本由经验丰富的组织病理学医师统一诊断。诊断结果分为：宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ及浸润性宫颈鳞癌＼[9＼]
124HPV L1壳蛋白的检测采用免疫组织化学SP的方法检测HPV L1壳蛋白，具体操作按组织或细胞HPV检测试剂盒（美国 Advanced 公司）说明书进行。结果判断标准：只要有1个被染红的病变细胞核的存在即判断HPV L1 蛋白检测为阳性。
13统计学处理
应用SPSS 150软件分析，计数资料采用χ2检验，；P>005，差异无统计学意义，P<005，差异具有统计学意义，P<001，差异具有显著性统计学意义。
2结果
21宫颈细胞学检查结果
宫颈液基细胞学检查筛查宫颈病变（CIN及以上）的灵敏度为7500%（216/288）、特异度为7154%（181/253）、阳性预测值7826%（216/276）、阴性预测值 7637%（181/237）。规定组织病理学检查结果上、下相差1级即为符合，以此计算符合率，宫颈液基细胞学检查与组织病理学检查的总符合率达 8223%（435/529）。见表 1。
22HPV L1壳蛋白在不同宫颈细胞学检查结果中的表达
HPV L1壳蛋白在所有患者中的阳性表达率为2911%，在不同宫颈细胞学检查结果NILM、ASCUS、 LSIL、HSIL、SCC中，HPV L1壳蛋白的阳性表达率分别为2015%、3529%、6363%、1839%、0%，HSIL组与 LSIL组的HPV L1壳蛋白的阳性表达率之间的比较，差异有显著统计学意义（P<001），SCC组与HSIL组和 LSIL组的HPV L1壳蛋白的阳性表达率之间的比较，差异均有显著统计学意义（P<001），随宫颈细胞学检查结果加重，HPV L1壳蛋白的阳性表达率减少。见表2。
23HPV L1壳蛋白在不同病理组织结果中的表达情况
从表3可知，在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈鳞癌中，HPV L1壳蛋白的阳性表达率分别为2616%、6076%、3098%、1654%、0%，CINⅠ组与CINⅡ、CINⅢ和宫颈鳞癌组的HPV L1壳蛋白阳性表达率之间差异性均具有统计学意义（P均<005）。CINⅠ、CINⅢ、宫颈鳞癌组与宫颈炎组之间比较，HPV L1壳蛋白阳性表达率差异性均具有统计学意义（P均<005）。随着病理组织结果CIN的加重，HPV L1壳蛋白阳性表达率呈下降趋势。
23HPV L1壳蛋白在不同HR-HPV DNA检测结果中的表达
依照有关文献，将HR-HPV DNA按负荷量分为4组：0～99 pg/mL，0～100 pg/mL，101～1000 pg/mL，>1000 pg/mL，各组的HPV L1壳蛋白阳性表达率分别为833%、1610%、3070%、5315%。随HR-HPV DNA 负荷量的增加，HPV L1壳蛋白阳性表达率明显升高（除了0～99 pg/mL组与0～100 pg/mL组之间差异无统计学意义，P>005，其与各组之间差异有统计学意义，P<005）。见表4。
24HPV L1壳蛋白阴性表达对CINⅡ以上高级组织病变的预测
HPV L1壳蛋白阴性表达检测CINⅡ以上高级组织病变的灵敏度为7894%（165/209）、特异度为6519%（206/316）、阳性预测值4400%（165/375）、阴性预测值2857%（44/154）。
3讨论
31HPV L1壳蛋白的表达特点
宫颈癌占女性恶性肿瘤发病率的第2位，是最常见的妇科恶性肿瘤之一[10，11]。在70年代初期，有人提出宫颈癌可能由人乳头瘤病毒（HPV）感染引起，在以后的诸多研究中这个结论被证实，HPV为球形DNA病毒，属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属。人类为HPV病毒的唯一宿主，HPV不仅能利用宿主细胞复制机制复制自身的DNA及转录成自身的RNA，同时利用胞浆蛋白合成HPV的壳蛋白L1和L2，再与裸核的HPV病毒组装成成熟的病毒颗粒，而L1壳蛋白是HPV主要的结构蛋白[12]。人体主要靠细胞免疫反应来抵御HPV的局部感染，HPV病毒的主要壳蛋白L1为细胞免疫杀伤HPV病毒的攻击位点，其与T细胞CD4/CD8及MHCⅠ/Ⅱ形成的免疫复合物能激活免疫连锁反应，并在局部形成高浓度的免疫抗体[13]。因此，当宫颈上皮细胞刚受到HPV感染且病毒处于复制阶段时，其特点是HPV L1壳蛋白在组织或者细胞中表达，此时，L1的表达反而有利于激发人体细胞免疫清除感染的细胞，但是当HPV病毒DNA整合到细胞核宿主基因后，HPV L1壳蛋白表达缺失，机体无法通过HPV L1壳蛋白激活免疫反应来清除病变细胞，进一步引发宫颈病变[14]。因此，HPV L1壳蛋白的表达意味着非进展性的病变，而其缺失则是HPV相关恶性转化的分子基础[15]。
32HPV L1壳蛋白的表达与宫颈病变的严重程度关系
本文研究发现，在慢性宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈鳞癌中，HPV L1壳蛋白的阳性表达率分别为2616%、5783%、3098%、1654%、0%，CINⅠ 中HPV L1壳蛋白的阳性表达率明显高于CINⅡ、CINⅢ和宫颈鳞癌，差异有显著统计学意义（P<001），结果表明，随着宫颈病变程度的加重，HPV L1壳蛋白阳性表达率呈下降趋势。本文同时研究了HPV L1壳蛋白在不同宫颈液基细胞学检查结果和不同HR-HPV DNA检测结果中的表达情况，结果显示，在不同宫颈细胞学检查结果NILM、ASCUS、 LSIL、HSIL、SCC中，HPV L1壳蛋白的阳性表达率分别为2015%、3529%、6363%、1839%、0%，其中LSIL中HPV L1壳蛋白的阳性表达率明显高于HSIL、SCC，差异有显著统计学意义（P<001），表明LSIL宫颈病变期时HPV L1壳蛋白呈现高表达的特点。随着宫颈病变程度的加重，进入HSIL期时HPV L1壳蛋白表达明显下降，进入SCC期后，HPV L1壳蛋白基本不表达，因此表明，随着宫颈细胞学检查结果加重，HPV L1壳蛋白的阳性表达率减少。在不同HR-HPV DNA检测结果中的表达结果显示，随HR-HPV DNA 负荷量的增加，HPV L1壳蛋白阳性表达率明显升高（除了0～99 pg/mL组与0～100 pg/mL组之间差异无统计学意义，P>005，其与各组之间差异有统计学意义，P<005）。这表明，在HR-HPV DNA大量复制的同时，HPV L1壳蛋白也在大量生成。
综上所述，本文采用免疫组织化学法检测HPV L1壳蛋白的表达，结果表明 HPV L1壳蛋白的表达与宫颈病变的严重程度存在一定关系，随着宫颈病变程度的加重，HPV L1壳蛋白阳性表达率呈下降趋势，对HPV L1壳蛋白的检测有助于对宫颈癌前病变的筛查和预防。
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（收稿日期：2015-03-27）