摘要：采用免疫胶体金电镜技术研究光暗适应条件下不同Ｃａ２＋浓度对罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergi）感光细胞中Ｇｑ蛋白α亚基亚细胞定位的影响。结果表明，对于光适应组，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中细胞质与感杆束中胶体金密度的比值是３．５１、２．１３和０．９３。对于暗适应组，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中细胞质与感杆束中胶体金密度的比值是３．０１、１．０８和０．４７。这些表明了罗氏沼虾感光细胞中Ｇｑ蛋白α亚基在暗适应条件下同时分配在感杆束和细胞质中。在光照和细胞质内Ｃａ２＋浓度适度升高的条件下，膜结合的Ｇｑ蛋白α亚基进而转化为可溶性的Ｇｑ蛋白α亚基。
关键词：罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergi）；感光细胞；Ｇｑ蛋白；Ｃａ２＋；免疫胶体金电镜
中图分类号：Ｑ９５９．２２３＋６３；Ｒ４４６．６１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）18－4141-03
Effects of Ca2+ Concentration on Subcellular Localization of Gq Protein α Subunit in Macrobrachium rosenbergi
ＦＥＮＧ Ｚｈｉ－ｇｕｏ，ＬＩＵ Ｈｕｉ－ｊｕａｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉｎｙａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｙａｎｇ ４６４０００，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ ｏｆ Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ ｗｉｔｈ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ｄａｒｋ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， ｔｈｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｔｈｅ ｇｏｌｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｒｈａｂｄｏｍ ｔｏ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｉｎ Ｍ． ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ ｉｎ ｈｉｇｈ Ｃａ２＋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｗ Ｃａ２＋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ３．５１， ２．１３ ａｎｄ ０．９３， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｈｉｇｈ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｗ ｃａｌｃｉｕｍ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ３．０１， １．０８ ａｎｄ ０．４７， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ Ｇｑ pｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｂｏｔｈ ｏｎ ｔｈｅ ｒｈａｂｄｏｍ ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｉｎ ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ ｏｆ Ｍ． ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ ｕｎｄｅｒ ｄａｒｋ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ ｓｏｌｕｂｌｅ Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ α ｓｕｂｕｎｉｔ ｕｎｄｅｒ ｌｉｇｈｔ ａｎｄ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｈｉｇｈ Ｃａ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉ； ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ； Ｇｑ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｃａ２＋； ｉｍｍｕｎｏｇｏｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ
免疫胶体金电镜是研究生物大分子在亚细胞水平的定位、进一步探讨大分子功能的最重要技术之一，ＩｇＧ具有双价性，它的一臂可结合到事先包被有抗原的胶体金上，也可以把抗体分子包被在胶体金上对细胞内的抗原进行定位。该技术首先用胶体金颗粒对抗原的抗体进行标记，然后用标记抗体对组织超薄切片进行免疫反应，有抗原存在的细胞结构即被胶体金颗粒标记，在电镜下根据胶体金颗粒的分布情况及密度即可确定抗原的亚细胞分布及相对含量。近年来胶体金探针己成为定位和分析多种蛋白质、多肽、多糖的有力工具，特别是在抗原酶及激素等物质的细胞免疫化学定位中更加显示了其独特的作用。
罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergi）感光细胞中Ｇｑ蛋白α亚基有可溶性和膜结合两种形式［１，２］，Ｇｑ蛋白α亚基在光感觉生理中的作用不仅取决于不同形式Ｇｑ蛋白α亚基含量的变化，而且与其在细胞内的分布密切相关［３－５］。采用生理生化的方法能测定不同形式Ｇｑ蛋白α亚基的含量，而采用免疫定位可以反映其细胞及亚细胞分布变化。采用免疫胶体金电镜技术研究光暗适应条件下不同Ｃａ２＋浓度对罗氏沼虾感光细胞中Ｇｑ蛋白α亚基的影响，以期从亚细胞水平揭示Ｃａ２＋与Ｇｑ蛋白α亚基之间的关系，为阐明Ｇｑ蛋白α亚基的作用机制及Ｃａ２＋在光感觉生理中的作用打下基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
罗氏沼虾购买于上海市漕河泾农贸市场，试剂、药品均为进口分装或国产分析纯。兔抗Ｇｑ蛋白α亚基的抗血清Ｃ端序列（ＩＭＹＳＨＬＶＤＹＦＰＥＹＤＧＰＱＲ）购买于美国Ｂｉｏｄｓｉｇｎ公司。
１．２ 方法
１．２．１ 样品的处理 将购买来的１２只罗氏沼虾随机平均分成２组饲养在河水中，一组于自然光下饲养６ ｈ后在自然光下解剖复眼，另一组于全暗的环境中饲养６ ｈ后在微弱的红光下解剖复眼。获取视网膜并放入孵育杯待用。将活的视网膜分别放入配制的生理溶液、高Ｃａ２＋溶液和低Ｃａ２＋溶液中。将两组样品（暗处理组的样品用遮光纸包住）都放在４ ℃下孵育２４ ｈ。
１．２．２ 样品的超薄切片 取视紫红质部分迅速放入固定液（４０ ｇ／Ｌ多聚甲醛和体积分数为０．５％的戊二醛）中，于４ ℃过夜。另一组在微弱的红光下取视紫红质部分迅速放入固定液中，于４ ℃过夜。用磷酸盐缓冲液和含有０．３ ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸的磷酸盐缓冲液分别清洗样品，然后用乙醇和丙酮脱水。用Ｅｐｏｎ８１２树脂包埋、聚合后，再把切好的超薄切片收集在镍铬网面上。
１．２．３ 样品的免疫标记和电镜观察 将镍铬网面向下漂浮在含体积分数为1％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００的磷酸盐缓冲液液滴上孵育３０ ｍｉｎ，转移镍铬网到封闭液液滴表面上孵育１ ｈ，转移镍铬网到一抗液滴表面上，于４ ℃孵育过夜，用磷酸盐缓冲液轻洗镍铬网面３次，每次５ ｍｉｎ，转移镍铬网到交联胶体金颗粒的二抗液滴表面上孵育１ ｈ。用磷酸盐缓冲液轻洗镍铬网面３次，每次５ ｍｉｎ，在室温下转移镍铬网到含体积分数为１％戊二醛的磷酸盐缓冲液液滴上固定３０ ｍｉｎ，用磷酸盐缓冲液清洗镍铬网面３次，每次３ ｍｉｎ，用去离子水清洗镍铬网面３次，每次３ ｍｉｎ。用醋酸铀及柠檬酸铅染色，于７５ ｋＶ下用ＨＩＴＡＣＨＩＨ－６００透射电镜观察、拍照。
２ 结果与分析
由表１可知，对于光适应组，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中细胞质与感杆束中胶体金颗粒密度的比值是３．５１、２．１３和０．９３。对于暗适应组，在高Ｃａ２＋溶液、生理溶液和低Ｃａ２＋溶液中细胞质与感杆束中胶体金颗粒密度的比值是３．０１、１．０８和０．４７。由图1和表1可知，罗氏沼虾感光细胞中Ｇｑ蛋白α亚基在暗适应条件下同时分配到感杆束和细胞质中。在光照和细胞质内Ｃａ２＋浓度适度升高的条件下，膜结合的Ｇｑ蛋白α亚基进而转化为可溶性的Ｇｑ蛋白α亚基。
３ 小结与讨论
罗氏沼虾感光细胞中Ｇｑ蛋白α亚基在暗适应条件下同时分配到感杆束和细胞质中。在光照和细胞质内Ｃａ２＋浓度适度升高的条件下，膜结合的Ｇｑ蛋白α亚基进而转化为可溶性的Ｇｑ蛋白α亚基。Ｇｑ蛋白α亚基亚细胞定位的变化是去十六酞化物的作用所导致的［５］。
免疫胶体金电镜技术现己在免疫化学和组织化学研究中得到了广泛应用，胶体金颗粒之所以能成为电镜下较为理想的免疫标记物，是因为它主要有如下优势：①胶体金颗粒在电镜下具有很高的电子密度，大小颗粒清晰可辨，且不影响对原有超微结构的观察。②通过计量被检部分的胶体金颗粒，可以对被检抗原或抗体进行免疫定量研究。
有一些关于异源三聚体Ｇ蛋白十六酞化物位点和亚细胞定位之间相冲突的关系的报道，研究认为从坚持α亚基的膜定位到坚持从膜到细胞溶质的活化依赖移位是去十六酞化物的作用导致［６］。对无脊椎动物感光器中Ｇｑ蛋白的定位研究较少，用免疫组织化学的方法在鲎侧眼的冰冻切片中观察免疫反应发现，ＦＩＴＣ荧光集中在小眼的视杆部位，在小眼的视网膜细胞或其他细胞的胞质中几乎没有免疫反应［７］。在超微结构定位上，用免疫胶体金标记了感光器中的Ｇｑ蛋白α亚基，光敏感的微绒毛部位的金粒密度是胞质部位的３倍以上。在鳌虾的感光器中，用同样的方法观察Ｇｑ蛋白α亚基，在光照条件下Ｇｑ蛋白α亚基从视杆微绒毛膜上移位至胞质中，在黑暗中又移回到视杆微绒毛膜上［７－１０］。Ｇｑ蛋白β亚基在光适应与暗适应时的定位模式与Ｇｑ蛋白α亚基非常相似，这表明它们定位的变化是同步的［４，５］。在多毛纲动物感光器中，免疫胶体金电镜技术表明Ｇｑ蛋白α亚基主要分布在视杆微绒毛的膜上。
十六酞化和去十六酞化对Ｇｑ蛋白α亚基的脂类修饰很可能是造成其形式转变的原因［４］。己发现乌贼的Ｇｑ蛋白α亚基的第３、４位点上的半胱氨酸残基是潜在的十六酞化的位点。用β－巯基乙醇处理乌贼感光器时，Ｇｑ蛋白α亚基及β、γ亚基从膜上分离出来，这表明一种不稳定的脂类修饰对Ｇｑ蛋白锚定到膜上起重要作用［６］。巯基乙醇可以解离Ｇｑ蛋白α亚基，且偶氮胂Ⅲ也可以解离鳌虾中Ｇｑ蛋白α亚基，已知高浓度的偶氮胂Ⅲ可以裂解硫脂或酯型脂肪酸键，用偶氮胂Ⅲ处理乌贼的感光器膜，发现膜结合的Ｇｑ蛋白α亚基从膜上解离出来［６］，表明硫脂的裂解产生了溶解性的Ｇｑ蛋白α亚基。因此推测可溶性的Ｇｑ蛋白α亚基的增加是由于脂肪酸从膜结合的Ｇｑ蛋白α亚基上移走，使得膜结合的Ｇｑ蛋白α亚基转变为无活性的可溶性的Ｇｑ蛋白α亚基。罗氏沼虾感光细胞中Ｇｑ蛋白α亚基的形式转变机制还有待进一步的研究。
参考文献：
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收稿日期：２０１２－０３－０１
基金项目：信阳师范学院青年骨干教师项目；河南省青年骨干教师项目
作者简介：冯志国（１９７９－），男，河南安阳人，副教授，博士，主要从事动物生物技术的研究工作，（电话）０３７６－６３９１３８０，１３６３６３９２８７０（电子信箱）
ｆｆｚｚｇｇ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ。