【摘 要】本文采用龙桂开浸银法对克氏原螯虾（Procambarus clarki）肠道嗜银细胞的形态学特点和分布密度规律进行了观察，结果显示：嗜银细胞在肠道各段均有分布，分布密度以前肠最多、中肠其次、后肠最少；嗜银细胞在肠道成群分布，大多数嗜银细胞呈圆形、卵圆形，也有些呈长条形、纺锤形、长颈瓶形、三角形、梨形等形态；克氏原螯虾肠道的组织化学反应可能与其食性和消化特性有关。
【关键词】克氏原螯虾；龙桂开浸银法；肠道；嗜银细胞
克氏原螯虾，又名克氏螯虾、红色沼泽螯虾或淡水龙虾，隶属甲壳纲、软甲亚纲、十足目、螯虾科 [1]，原产于美国南部和墨西哥北部，后由日本传入中国。克氏原螯虾因其食性杂、生长快、繁殖和抗病能力强而种群发展迅速，广泛分布在全国各地的湖泊、江河、池塘、沟渠、沼泽和稻田中，已成为重要的经济水生动物，并已经取得大规模人工养殖的成功。
国内对克氏原螯虾的研究主要涉及其幼体发育、营养成分及其他一些生物学方面的内容[2，3]，对其肠道的基础研究很薄弱。龙桂开浸银法是使用较广且能比较全面地反映消化道内分泌细胞总量的一种染色方法[4]。在动物的进化过程中，肠道嗜银细胞起源较早，广泛存在于各类脊椎动物的消化道中[5，6]，但在无脊椎动物中报道较少，尚未见关于克氏原螯虾的报道。通过对其消化道嗜银细胞的分布及形态特点的试验，可进一步丰富比较内分泌学资料，更能比较多地了解克氏原螯虾肠道的组织化学结构特点。
1 材料与方法
1.1 材料
实验用克氏原螯虾于2013年7月由南陵县烟墩水产养殖专业合作社提供，共8只，平均体重为24g，平均全长为10cm。
1.2 取材
将8只克氏原螯虾取出，用电子秤称重（±0.001g），用直尺测量全长（±0.1cm），并记录。活体解剖，用镊子将肠道从内脏中分离出来，并清除表面的脂肪和肝胰脏组织，然后用镊子将肠道内的水分和食物颗粒碾出，剪取前肠、中肠和后肠各2段。
1.3 龙桂开浸银法
（1）取材：清洗出3支干净的容器（如废弃的青霉素瓶子），并标上标签（前肠、中肠、后肠），将对应的组织块放入，用15%～20%福尔马淋溶液固定3～5d。
（2）浸洗：用蒸馏水每隔0.5h换洗1次，共换洗3h，之后用解剖刀将组织块修整成长约5mm、宽3mm的小块。
（3）浸银：将组织块浸入25%的硝酸银水溶液中，用滤纸将容器包裹起来，使其处于黑暗状态下，避免硝酸银受光氧化分解，然后放入37℃的恒温箱中1～3d。
（4）用蒸馏水冲洗数次。
（5）浸入银氨溶液中，浸泡3～5h。
（6）用蒸馏水略洗。
（7）还原：浸入福尔马淋溶液中还原10～15h。
（8）用蒸馏水再次浸洗数分钟。
（9）脱水：采用酒精脱水，浓度梯度分别为50%、70%、80%、90%、95%、无水酒精，每2个梯度的间隔时间为2h，最后用无水酒精重复脱水1次，然后依次将这些浓度的酒精倒入有组织块的容器中。
（10）将脱完水的组织块放入无水乙醇∶二甲苯=1∶1的溶液中浸泡1.5h。
（11）透明：采用二甲苯为透明剂，将脱水后的材料直接投入二甲苯溶液中浸泡20min。
（12）浸蜡：透明后将组织块置入二甲苯∶石蜡=1∶1的混合液中约1.5h，之后放进液状石蜡中浸蜡，放入57℃的烘箱中12h。
（13）石蜡包埋：折叠数个长方形纸盒，并将写有前、中、后肠的标签贴上，将纸盒放入1个较大一点的方形硬纸壳中，在硬纸壳底部开1个小洞，以便水能顺利流出，把烘箱中的液状石蜡倒入小纸盒中，迅速将组织块放入纸盒中的液状石蜡中，组织块的纵向要与小纸盒的纵向保持平行（便于以后修整石蜡，切片时能顺利切出肠道的横切面），然后往摆有小纸盒的大硬纸壳中源源不断的注入自来水，以加速冷却，待石蜡基本固定后，将小纸盒从大硬纸壳中取出，放入装有自来水的水盆中冷却数小时，直至石蜡完全凝固成形。
（14）切片、展片、贴片：将包埋有组织块的石蜡从小纸盒中取出，按纵向修整成等腰梯形（后部留大一点容易将其固定在小木块上），且6个平面要比较平滑，组织块四周均留有余蜡，将石蜡块按照不同批次和前、中、后肠分开，然后放进1个小塑料袋中，并标上写有批次和前、中、后肠的标签。将修好的石蜡块与小木块放在酒精灯上微烤，把石蜡块粘在小木块上，把粘好的木块固定在切片机上，把切片机的刻度调为6μm，手摇动切片机，即可切出6μm厚的组织片，用毛笔接住切出的组织片，放在准备好的滤纸上（事先准备好滤纸和水盆，水盆中倒入37～42℃的温水，放入温度计，以便及时调整水温），然后挑出较完整的2～3片，用镊子夹住，迅速展入37～42℃的温水中，让其充分展开，待组织片上的小气泡完全消失后，用涂有中性胶的载玻片将组织片捞出，让其附着于载玻片上，1个载玻片上放2段标本，并将写好批次和前、中、后肠的标签纸贴上，放入染色缸中，将载玻片置于40.5℃的烘箱中烘烤2～3d。
（15）脱蜡：把烘箱中装有载玻片的染色缸取出，倒入二甲苯脱蜡15min以上，然后移入另一个染色缸，再次脱蜡15min。
（16）将脱过蜡的载玻片一一摆在滤纸上，然后从烘箱中取出准备好的盖玻片。在组织片段上滴1滴中性树胶之后，让盖玻片与载玻片呈45角，缓慢放下盖玻片盖住组织片，然后放入37℃烘箱中烘片3～4d。
1.4 观察分析
（1）把做好的切片放在光学显微镜下用10×40倍的镜片观察，以一个视野为单位计嗜银细胞的个数，并记录。
（2）通过SAS of Windows 8.01 软件，把记录的数据进行方差分析，得到试验结果。
2 结果
嗜银细胞的胞质与突起中充满嗜银颗粒，嗜银颗粒呈黑色或黑棕色，背景为淡黄色或黄色，细胞核被染成黄色或浅黄色，对比非常鲜明，容易辨认与区分。
2.2 嗜银细胞的形态学特点
嗜银细胞的形状多种多样，有圆形、卵圆形、长条形、纺锤形、长颈瓶形、三角形、梨形以及其他各种不规则形状，并有突起，其中8O%嗜银细胞呈圆形和卵圆形，l0%左右为条形，其余为其他不同的形状。
2.3 嗜银细胞的分布密度
3 讨论
3.1 嗜银细胞的形态学特点与生理机能
克氏原螯虾肠道上的嗜银细胞多为开放型细胞，主要有圆形、卵圆形，长条形、纺锤形、长颈瓶形、三角形、梨形等形态，这种形态特点揭示了形态随所处部位的相邻上皮细胞的排列方式以及本身功能所需而各异。嗜银细胞是肠道的内分泌细胞，早在本世纪初就有学者对嗜银细胞进行了研究，确认嗜银细胞是一种内分泌细胞。也有一些学者支持外分泌功能，还有些学者认为嗜银细胞具有内、外分泌2种功能。肠道内分泌细胞能接受化学和物理刺激，并释放5-羟色胺和各种激素到循环血液中去。本文也观察到，嗜银细胞从突起穿过基膜到达固有层，也见嗜银颗粒直接从细胞到达固有层，另外还见有许多细胞的突起末端有散在的嗜银颗粒，并靠近固有层，这和黄威权[7]等人观点一样，他们也认为嗜银颗粒可以通过扩散和直接释放2种形式到固有层。现在研究结果表明，鱼类肠道内分泌细胞释放的激素对靶细胞有4种生理作用方式，即内分泌、旁分泌、神经内分泌和腔内分泌。本试验证实了克氏原螯虾至少有其中2种方式，即内分泌和腔内分泌；关于旁分泌，本文也观察到少量嗜银细胞有突起伸向邻近细胞，这为此种方式的存在提供了形态学证据。
3.2 嗜银细胞的分布密度规律
到目前为止，国内外学者仅在几十种鱼的胃肠道中发现嗜银细胞，本试验观察到克氏原螯虾的肠道中有着丰富的嗜银细胞。克氏原螯虾嗜银细胞以细胞群的形式分布在肠道的前、中、后肠，从前肠、中肠到后肠的分布密度呈递减趋势。这种分布规律与克氏原螯虾的肠道消化特点相适应，因为食物首先进入肠道中的前肠，刺激前肠的嗜银细胞分泌激素，此时食物对前肠有较大的机械刺激作用，食物中的化学成分浓度最大，所以前肠的嗜银细胞最为丰富，因而加强了激素的分泌。随着食物消化吸收的进程，食物对肠的机械和化学刺激减弱，嗜银细胞的分布密度渐疏。
笔者认为，在对克氏原螯虾的肠道组织化学研究中，由于自己在试验中的种种失误和操作不熟练，也可能会导致某些结论比较片面，具体的研究结论还有待进一步的研究加以证明。
参考文献
[1]堵南山.甲壳动物学（下）[M].北京科学出版社，1993：821-822.
[2]郭晓鸣，朱松泉.克氏原螯虾幼体发育的初步研究[J].动物学报，1997，43（4）：372-381.
[3]温小波，库天梅，罗静波.克氏原螯虾耗氧率及窒息点的研究[J].大连水产学院学报，2003，18（3）：170-174
[4]曾小鲁.实用生物学制片技术[M].北京高等教育出版社，1989：177-178.
[5]El-Salhy， M Grimelius L.The endocrine cells of the gastro- intestinal mucosa of a squamate reptile .The grass lizard （Mabuya quinquetaeniata）.A histological and immuno-histochemical study.Biomedical Research，1985，6（6）：371-375.
[6]唐晓雯，郑一守.不同脊椎动物消化道内52羟色胺免疫染色细胞的分布[J].动物学研究，1991，12（3）：293-298.
[7]黄威权，黄荫乔，王文超等.大鼠小肠嗜银、亲银细胞的分布及形态学观察[J].解剖学报，1985，16（4）：412-416.