摘 要：通过对‘2004-6-12’(魏可实生)、‘2004—2—30’(巨峰实生)及魏可(对照)葡萄花器官特征、花粉萌发率、花粉粒形态、成熟花粉粒内部结构以及花药、小孢子发育过程细胞学特征的观察，研究了葡萄雄性不育的特性。结果表明，‘2004—6-12’和‘2004—2—30’的花粉无生活力，花粉粒P／E值分别为(1.13±0.05)和(1.12±0.04)，均为近球形，且无发芽孔和发芽沟；花粉粒横切面边缘光滑，外壁纹饰分别为网状和穴状。魏可(对照)花粉粒极轴值与赤道轴值之比(P／E值)(2.11±008)，为长球形，萌发沟为三孔沟型，外壁纹饰为孔穴状。‘2004—6—12’和‘2004—2-30’小孢子败育主要发生在单核早期，但‘2004—6—12’在小孢子母细胞减数分裂期就表现出部分异常，表明2者的小孢子败育可能与绒毡层提前解体有关。
关键词：葡萄；雄性不育；花粉特性；细胞学特征
中图分类号：S663.1 文献标识码：A 文章编号：1009—9980(2010104—514—07
葡萄为葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis)植物，我国以栽培鲜食葡萄为主。当前，选育优质无核葡萄新品种已成为国内外，特别是发达国家葡萄育种的重要目标之一。无核葡萄根据其授粉结实的特性可分为单性结实和假单性结实(种子败育型)两类生产上获得无核葡萄的途径，一是选用无核品种，二是利用植物生长调节剂对有核品种进行无核化处理，促其形成无核果实。无论是由遗传因素还是外在因素刺激形成的无核，其本身都需要有单性结实能力，而雄性不育是导致果实无籽的重要遗传因素之一。
果树上利用雄性不育作母本杂交可省去去雄过程，简化育种程序，提高效率。目前，有关葡萄雄性不育和败育的时期及其方式的研究较少。‘2004—6—12’(魏可实生)和‘2004—2—30’(巨峰实生)为南京农业大学选育的优良单株，前者自然授粉的果穗大小粒现象严重，出现大量无核果，花前套袋全为无核果实，雄蕊花丝短，且反卷；后者雄蕊花丝短，且反卷，花前套袋不结实，花穗枯萎。为确定‘2004-6-12’(魏可实生)和‘2004-2-30’(巨峰实生)的可育性，连续两年对其进行鉴定试验，探讨2者雄性不育的败育过程和途径，旨在为分析和利用不育材料提供实验依据。
1 材料和方法
‘2004-6-12’(魏可实生)、‘2004-2-30’(巨峰实生)分别为播种魏可、巨峰葡萄自交种子实生选种。于2004年春播种。当年6月定植。‘2004-6-12’(魏可实生)部分植株于第2年始花，大部分植株播种后第三年开花结果；2006年自然授粉果穗大小粒现象严重，出现大量无核果，2007年，花期观察，雄蕊花丝短，且反卷。‘2004-2-30’(巨峰实生)于2007始花，2008年花期观察，雄蕊花丝短，且反卷，花前套袋不结实，花穗枯萎。选用雄性不育种质‘2004-6-12’(魏可实生)、‘2004-2-30’(巨峰实生)为材料，以魏可(Wink)为对照，采集于南京农业大学基地。
1.1 花器外部形态观察
盛花期(5月中下旬)田间观察花蕾100个，从花序的上中下部位分别采集花蕾5个，使用德国产MoticK-400L体视显微镜拍照，观察花器官外观形态。
1.2 花粉制备
花前1周(4月中旬)将5穗花序套袋，采集初花期花蕾100个，在实验室用镊子取下大蕊花花药2g于培养皿中，25℃培养24h，收集花粉，干燥、低温条件下备用。
1.3 花粉生活力测定
取干燥、低温条件下备用花粉参照胡适宜的离体萌发法培养，在100mL的蒸馏水中，加琼脂1g，蔗糖10g，硼砂0.1g，烧杯中加热煮沸，用玻棒滴一滴培养基于载玻片，冷却后用毛笔蘸花粉少许，均匀撒于培养基表面，保湿，25～30℃培养24h。在光学显微镜100倍下检测发芽情况，每个载玻片上统计5个视野的花粉粒数和萌发数。
1.4 花粉粒形态、大小观察
花粉经处理后喷金镀膜(日立E-1010离子溅射仪)，分别于2008年6月12日和2009年6月16日，在扫描电镜(日立S-3000N型)下观察拍照。结合2次拍照测量20粒花粉的赤道轴、极轴，计算极轴值(P)／赤道轴值(E)值，观察、描述外壁纹饰。花粉形状分类参照王开发P／E比值法；大小分类参照牛立新等应用标准差法对葡萄花粉粒大小提出的分类标准。
1.5 花粉粒内部结构观察
花粉经含2.5％的戊二醛的多聚甲醛初固定12h以上，1％四氧化锇后固定2h，丙酮梯度脱水，Epon 812环氧树脂包埋，经power tome-XL型超薄切片机制成70nm切片，经醋酸双氧铀和柠檬铅双染色(醋酸双氧铀30min，柠檬酸铅30min)，于2009年6月17日在日立H-7650透射电镜观察。
1.6 花药及小孢子细胞学观察
‘2004-6-12’、‘2004-2-30’和魏可分别从幼蕾期到初花期(2008年、2009年4月中旬一5月中上旬)，每4d采样1次，FAA固定，4℃保存。参照常规石蜡切片法制片㈣，用光学显微镜观察并拍照。
2 结果与分析
2,1 花器外部形态观察
与魏可相比，‘2004-6-12’和‘2004-2-30’开花后花器官外部结构表现出雄蕊花丝短，花药反卷，且整穗花序中花丝翻卷率为100％，呈葡萄雄性不育(雌能花)的外观形态(图版I-A1、A2、A3)。
2.2 花粉生活力的测定
‘2004-6-12’、‘2004-2-30’花粉粒无萌发，萌发率为0，而魏可花粉粒发芽达85.1％，可见‘2004-6-12’、‘2004-2-30’不具有发芽能力(表1)。
2.3 花粉形态学观察
对‘2004-6-12’、‘2004-2-30’和魏可花粉粒扫描电镜观察结果表明，花粉粒与魏可形态存在较大差异(图版I)。‘2004-6-12’花粉粒P／E=(1.13～0.05)，‘2004-2-30’花粉粒P／E=(1.12～0.04)，均是近球形(图版I-B1、B2)，魏可P／E值为(2.11～0.08)，形状为长球形(或者称为椭球形)(图版I-B3、B7)，极道面观为钝三角形(图版I-B8)。
2.3.1 花粉粒的大小比较从表1中可以看出，‘2004-6-12’极轴(P)为(24.53～2.78)(20.36～27.67)，属于雌能花中的中型花粉类型，‘2004-2-30’极轴(P)为(32.18～1.57)(28.87～34.00)属于大型花粉，魏可极轴(P)(29.79～1.63)(29.38～30.20)均属于中型花粉类型。
2.3.2 花粉粒的表面纹饰比较‘2004-6-12’单株花粉粒壁纹饰为网状(图版I-B4)，‘2004-2-30’表面纹饰为穿孔状(图版I-B5)，而魏可纹饰为穴状(图版I-B6)。花粉萌发孔，从花粉粒电镜观察发现，魏可的花粉均为三沟孔型，极道面上为钝三角形，萌发沟中通常有清晰的萌发孔。萌发孔上附有乳头状突起(图版I-B6)，但‘2004-6-12’、‘2004-2-30’的饱满花粉均未发现有萌发沟和萌发孔的存在。
2.4 花粉粒内部结构观察
对‘2004-6-12’、‘2004-2-30’和魏可成熟花粉粒进行随机切片，在透射电镜下观察内部结构。结果表明，‘2004-6-12’、‘2004-2-30’花粉粒横切面为近圆形(图版I-Cl、C2)，横切面周边较光滑，没有发现花粉粒发芽沟凹陷，进一步说明花粉粒没有发芽沟；内部结构内含物质地不均匀(图版I-C4、C5)。魏可花粉粒横切面周边粗糙(图版I-C6)，有3条萌发沟凹陷(图版I-C3)，内含物质地紧密。
2.5 花药细胞学观察
‘2004-6-12’、‘2004-2-30’与魏可花蕾造孢期横切面相同，含4-5枚雄蕊，每一花药由4个花粉囊和1个药隔组织构成(图版Ⅱ-B1)，花药横切呈蝶形，花粉囊壁由表皮层、药室内壁、中层和绒毡层组成，呈同心圆排列，圆心处为花粉母细胞(图版Ⅱ-A1)，其特点为：细胞质浓厚、液泡小、细胞核大，至花粉母细胞时期3个供试材料发育无明显差异。
减数分裂时期，魏可小孢子母细胞之间形成胼胝质壁，细胞逐渐分散开来，此时绒毡层具退化痕迹细胞形状开始不规则，排列也疏松且多为2～4个核仁；中层细胞变扁平，储藏物质减少，以后逐步被吸收(图版Ⅱ-A2)。‘2004-6-12’部分花药的药室的花粉母细胞出现异常解离(图版Ⅱ-B2)，大部分药室的花粉母细胞能正常发育到四分体时期(图版Ⅱ-B3)。‘2004-2-30’此时发育正常。
四分体时期，魏可四分体周围被胼胝质包围，排列方式是四面体形，小孢子母细胞的分裂方式属于同时型(图版Ⅱ-A3)，此时为绒毡层最为活跃时期，药室内壁径向壁长于弦向壁，并产生不均匀的与径向壁平行的条状增厚，中层解体。大部分‘2004-2-30’药室在四分体发育正常。
单核早期(图版Ⅱ-A4)，魏可绒毡层细胞表现切向生长，弦向壁长于径向壁，细胞之间连接紧密，小孢子核小、壁薄、细胞质较浓、无液泡位于细胞中央。‘2004-6-12’部分药室绒毡层提前解离，出现多核花粉粒和空壳花粉粒。‘2004-2-30’部分药室绒毡层已完全消失，出现多核花粉粒，内涵物质外溢相互粘连在花药中央，同时存在没有正常解离的四分体小孢子(图版Ⅱ-C2)。
单核晚期，细胞质中的小液泡联合成大液泡将细胞核挤到一边，此时在部分魏可小孢子上有3条清晰可见萌发沟(图版Ⅱ-A5)。
双核花粉期，魏可花粉粒积累营养物质，染色较深，此时，绒毡层显著解体，核消失，内含物消失殆尽，药室内壁条纹状增厚明显(图版Ⅱ-A5)。‘2004-6-12’、‘2004-2-30’部分小孢子在单核晚期可以正常解离的小孢子进入到双核花粉期，绒毡层细胞核消失，组织崩溃；小孢子无核，染色浅，表现出高度的液泡化，形成空泡花粉(图版Ⅱ-B5、C3)。
成熟花粉粒时期，魏可花粉粒形状一致，染色较深，均匀分布在药室内，随后每侧的2个药室之间药隔消失而连成一体，裂腔裂开散出花粉(图版Ⅱ-A7)。‘2004-6-12’部分药室因为绒毡层提早解离致使小孢子发育过程中缺乏营养而丧失活力，小孢子染色浅，且有多数停留在单核小孢子阶段，同一药室内还有少量貌似发育正常，染色较深的花粉粒：药室内壁能够正常加厚，花药也能正常开裂(图版Ⅱ-B6)。‘2004-2-30’药腔裂开，发育没有成熟的花粉粒与畸形花粉相互粘连不能自由散粉(图版Ⅱ-C4)。
在‘2004-6-12’部分花药中发现不分化的薄壁细胞团，不形成初生壁细胞和初生造孢细胞，也没有药室内壁、中层及绒毡层的分化，没有小孢子母细胞的形成，不存在小孢子的发生及发育，不具有可育花药的药室结构(图版Ⅱ-B7)。
3 讨论
‘2004-6-12’和‘2004-2-30’雄蕊花丝短，花药反卷，形状均为近球形，没有萌发沟，形态特征与贺普超、牛立新等、李鸿莉等对葡萄雄性不育(雌能花)描述一致，属于典型的葡萄雄性不育(雌能花)类型。‘2004-6-12’和魏可属于中型花粉粒，‘2004-2-30’属于大型花粉粒，这可能与倍性不同有关。与魏可相比成熟花粉横切内含物稀疏、表面光滑，花粉无生活力。依据赵丽梅等㈣(大豆)、姚克敏等(水稻)中育性划分标准，败育属于完全雄性不育(花粉可育度<3％)。
不同植物种类的雄性不育系甚至同一种类的不同雄性不育系败育的时期和方式都是不同的，且是多种多样的，在花粉发育的所有阶段败育都有可能发生，败育机制涉及不止一个。单子叶植物多数在单核至双核期，双子叶植物多发生在四分体至小孢子形成期。龙欢等引研究3种甘蓝型油菜雄性不育系，因质、核不同，败育时期也不相同。郭艳玲等㈣研究发现新高梨小孢子败育主要发生在单核晚期，在小孢子母细胞减数分裂期就表现出部分异常。本研究结果显示，与新高不同的是‘2004—6-12’和‘2004—2-30’败育主要发生在单核早期，但是‘2004-6-12’在小孢子母细胞减数分裂期就表现出部分异常。
‘2004-6-12’和‘2004-2-30’败育主要有以下特点：首先，空粒花粉的形成。多数研究认为，花粉败育是因为绒毡层异常，即绒毡层细胞在花粉形成和发育过程中过度肥大液泡化、提前或延迟退化。罗来水等旧认为：绒毡层细胞液化解体或增生解体发生在单核花粉晚期到二核期，通常导致空粒花粉的形成；花粉母细胞减数分裂的异常也是造成空粒花粉的因素之一。本研究中绝大多数‘2004-6-12’与‘2004-2-30’花药中出现的大量空壳花粉粒是由于绒毡层细胞程序化死亡发生紊乱，提前降解，导致大部分小孢子得不到足够的营养物质造成。李莹莹等在辣椒雄性不育系细胞学观察中观察到花粉母细胞减数分裂异常导致产生空粒花粉，在部分‘2004-6-12’花药中观察到类似现象。其次，小孢子发生异常。‘2004-2-30’成熟花粉粒时期小孢子内含物外溢、相互粘连不能正常散粉。这与王福青等㈣研究的大白菜雄性小孢子的研究有相似之处。第三，‘2004-6-12’部分花粉母细胞分解解体，可能是绒毡层细胞的行为异常而处于饥饿状态造成。在‘2004-6-12’观察到为数不多不分化的造饱细胞，它的发生也可能是败育的原因之一，但其与败育的关系和机理还待进一步研究。
‘2004-6-12’、‘2004-2-30’部分花药发育过程中，花药内壁、中层、绒毡层等都能按照正常途径生长发育、解体、消失，至花蕾即将开放时，花粉囊中有大量看似发育良好的花粉，但经连续2a进行花粉培养萌发试验，花粉基本无萌发力，罗来水等对白花重瓣碧桃、台砂早等的研究中也发现相似情况。有关花粉萌发王台等_认为：成熟的花粉中积累大量的已合成的mRNA，在花粉萌发时，这些mRNA被翻译成蛋白质，后者用于花粉的萌发和花粉管的伸长。本实验对花药发育的各个时期蛋白质及脯氨酸含量不育种质均低于可育种质，蛋白质水平低下可能是该类花粉不育的原因。据此我们判定‘2004-6-12’和‘2004-2-30’均属于功能性雄性不育。植物雄性不育是由基因控制的，本试验的花粉活力是基因表达的结果，因此控制能正常产生花粉的基因可能更为复杂些，与此相关的基因尚有待于进一步研究。
4 结论
‘2004-6-12’和‘2004-2-30’从花器官外部形态、花粉形态、花粉大小、花粉内部结构方面与魏可有显著差异，花粉没有活力，属于典型的葡萄雄性不育种质。果实产量、品质、外观方面较好，育种和生产利用价值较高。‘2004-6-12’小孢子败育主要发生在单核早期，但在小孢子母细胞减数分裂期就表现出部分异常；‘2004-2-30’小孢子败育也主要发生在单核早期。而此前发育正常。说明‘2004-6-12’和‘2004-2-30’小孢子败育可能与绒毡层提前解体有关。
